Полимеразная цепная реакция принцип. Основные принципы метода полимеразной цепной реакции

ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия

имени -Ясенецкого Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию »

Кафедра медицинской генетики и клинической нейрофизиологии ИПО

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Методическое пособие для студентов 3-4 курсов

по специальностям лечебное дело (060101) и

Красноярск - 2007

Шнайдер, Н. А., Бутьянов, Р. А. Основные принципы метода полимеразной цепной реакции. Методическое пособие для внеаудиторной работы студентов 3-4 курсов по специальностям лечебное дело (060101) и педиатрия (060103). – Красноярск: Изд-во ГОУ ВПО КрасГМА, 2007. – 42с.

Методическое пособие полностью соответствует требованиям Государственного стандарта (2000) и отражает основные аспекты современного метода диагностики наследственных заболеваний человека – метода полимеразной цепной реакции, учебный материал адаптирован к образовательным технологиям с учетом специфики обучения на 3-4 курсах лечебного и педиатрического факультетов.

Рецензенты: заведующая кафедрой медицинской генетики ГОУ ВПО

«Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», д. м.н., профессор;

Репликация ДНК

Объектом исследования данного метода является Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). ДНК является универсальным носителем генетической инфор­мации у всех существующих на Земле организмов (исключение - РНК-содержащие микроорганиз­мы). ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из соеди­ненных последовательно нуклеотидов. Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5"-концу одной нити соответствует 3"-конец второй нити. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. Данный процесс называется репликацией . Репликация молекулы ДНК происходит в синтетический период интерфазы. Каждая из двух цепей «материнской» молекулы служит матрицей для «дочерней». После репликации вновь синтезированная молекула ДНК содержит одну «материнскую» цепочку, а вторую - «дочернюю», вновь синтезированную (полуконсервативный способ). Для матричного синтеза новой молекулы ДНК необходимо, чтобы старая молекула была деспирализована и вытянута. Репликация начинается в нескольких местах молекулы ДНК. Участок молекулы ДНК от точки начала одной репликации до точки начала другой называется репликоном .

Начало репликации активируется праймерами (затравками), состоящими из 100-200 пар нуклеотидов. Фермент ДНК-хеликаза раскручивает и разделяет материнскую спираль ДНК на две нити, на которых по принципу комплементарности при участии фермента ДНК-полимеразы собираются «дочерние» цепи ДНК. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока - небольшого начального двухцепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии праймера, с комплиментарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. В каждом репликоне ДНК-полимераза может двигаться вдоль «материнской» нити только в одном направлении (5`=>3`).

На лидирующей нити по мере раскручивания репликона постепенно непрерывно наращивается «дочерняя» цепь. На отстающей нити дочерняя цепь синтезирует также в направлении (5`=>3`), но отдельными фрагментами по мере раскручивания репликона.

Таким образом, присоединение комплементарных нуклеотидов «дочерних» нитей идет в противоположных направлениях (антипараллельно). Репликация во всех репликонах идет одновременно. Фрагменты и части «дочерних» нитей, синтезированные в разных репликонах, сшиваются в единую нить ферментом лигазой. Репликация характеризуется полуконсервативностью, антипараллельностью и прерывистостью. Весь генном клетки реплицируется один раз за период времени, соответствующий одному митотическому циклу. В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная (рис. 1).

Рис. 1. Схема репликации молекулы ДНК.

Таким образом, цикл репликации ДНК включает в себя три основные стадии:

1. расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация);

2. присоединение праймеров;

3. достраивание цепи дочерней нити.

Принцип метода ПЦР

Именно репликация ДНК легла в основе ПЦР. В ПЦР перечисленные выше процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании рас­твора до 93-95°С происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу - присоедине­нию или "отжигу" праймеров - инкубационную смесь охлаждают до 50-65°С. Далее смесь нагревают до 70-72°С - оптимум работы taq-ДНК-полимеразы - на этой стадии происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова. Другими словами метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация ) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК - полимеразой.

Наращивание дочерних нитей ДНК должно идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, поэтому для репликации второй цепи также требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера: один для "+"-цепи, второй для "-"-цепи. Присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов.

Этапы ПЦР

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающие при различных температурных режимах (рис. 2).

· 1 этап: денатурация ДНК. Протекает при 93-95° в течение 30-40 сек.

· 2 этап: отжиг праймеров. Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответст­вующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического уча­стка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой распола­гаются в интервале 50-65°С. Время отжига 20-60 сек.

· 3 этап: достраивание цепей ДНК.Комплиментарное достраивание цепей ДНК происходит от 5"-конца к 3"-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения прай­меров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом taq-полимеразой и проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование специфического фрагмента ДНК–ампликона (рис. 3). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей.

Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2", где п - число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента ме­тодом электрофореза в агарозном геле.

Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе ), который по заданной программе автоматчески осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты:

· ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

· Праймеры (синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента). Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.

· Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК в эквивалентных концентрациях 200-500 мкм)

· Фермент Taq -полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК, 2-3 мМ).

· Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента, PH 6,8-7,8).

Для определения специфических участков генома РНК-содержащих вирусов , сначало получают ДНК-копию с РНК-матрицы, используя реакцию обратной транскрипции (RT), катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).

Рис. 2. Амплификация (1-ый цикл).

Рис. 3. Амплификация (2-ой цикл).

Основные области применения ПЦР

· клиническая медицина:

o диагностика инфекций,

o выявление мутаций, в том числе диагностика наследственных заболеваний,

o генотипирование, в том числе HLA-генотипирование,

o клеточные технологии

· экология (как способ мониторинга состояния и качества объектов окружающей среды и продуктов питания)

· определение трансгенных организмов (ГМО)

· идентификация личности, установление отцовства, криминалистика

· общая и частная биология,

Основные принципы

организации диагностических лабораторий

Работы в ПЦР-лаборатории проводятся согласно "Правилам устройства, техники безопасности , производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в ла­бораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждениях системы здравоохранения.

Контаминация образцов ДНК

Проведение ПЦР-диагностики связано с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, - возможностью контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК - ампликонов; ДНК-стандарта, используемого в качестве положительного контроля; положительной ДНК клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложноположительных результатов.

В процессе работы могут встретиться два вида контаминации :

1. перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположи­тельных результатов;

2. контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, т. к. в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продук­тами для реамплификации.

Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабора­торного оборудования, поверхности лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложноположительных результатов. Определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных за­трат времени и средств. Накопленный к настоящему времени опыт работы лабораторий, исполь­зующих метод ПЦР для диагностики позволяет сформулировать основные требования к организа­ции таких лабораторий и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований позволяет исключить возможность контаминации и получения ложноположительных результатов.

Стадии проведения ПЦР анализа

Территориально разделяют, размещая их в отдельных помещениях (рис.4,5):

· Пре-ПЦР-помещение, где производится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с исследуемыми агентами, ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

· Пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации. В этом помещении допускается использовать другие методы детекции. Желательно комнату детекции продуктов амплификации расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.

Рабочие помещения оснащены ультрафиолетовыми лампами с максимумом излучения в области 260 нм (типа ДБ-60) из расчета 2,5 Вт на 1 м3. Лампы расположены так, чтобы прямому облучению подвергались поверхности рабочих столов, оборудование и материалы, с которыми имеет контакт оператор во время проведения ПЦР-анализа. Облучение проводится в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы.

Врачи-лаборанты работают в специальной лабораторной одежде, сменяемой при переходе из одного помещения в другое, и в одноразовых перчатках. Обработка одежды из разных помещений произво­дится отдельно. На разных этапах проведения ПЦР-анализа работают различные сотрудники.

Для работы используют отдельные наборы дозаторов, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования , халатов и перчаток предназначенные для различных стадий анализа и не переносимые из одного помещения в другое. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате имеют соответствующую маркировку.

Все этапы работы проводят только с использованием одноразовых расходуемых материалов: наконечников для автоматических пипеток, пробирок, перчаток и т. д. Обязательно меняют наконечни­ки при переходе от пробы к пробе. Необходимо использовать наконечники с фильтром - аэрозоль­ным барьером для предотвращения попадания микрокапель раствора в пипетку. Использованные пробирки и наконечники сбрасываются в специальные контейнеры или емкости, содержа­щие дезинфицирующий раствор. Клинические образцы хранят отдельно от реагентов.

Для обработки и уборки рабочего места в каждом помещении имеется ватно-марлевые тампоны (салфетки), пинцет, дезинфицирующий и инактивирующий растворы.

В ПЦР-диагностической лаборатории исключается проведение работ, связанных с получени­ем (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей, которые диагностируются в данной лаборатории.

Забор клинического материала

Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты.

Забор материала производится в условиях процедурного кабинета соответствующего профиля. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию.

Забор образцов необходимо производить при помощи стерильного, желательно одноразового, инструментария только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150°С в течение 1 часа.

Зона детекции (другой этаж или другое здание).

Рис. 4. Устройство ПЦР-лаборатории с детекцией электрофорезом.

Зона детекции (другой этаж или другое здание)

Рис. 5. Устройство ПЦР-лаборатории с флуоресцентной детекцией (количественный анализ).

Рис. 6. Комната выделения ДНК. Показан настольный бокс с бактерицидной лампой.

Рис. 7. Комната амплификации.

Рис. 8. Комната детекции.

Рис. 9. Образцы крови для ДНК-диагностик наследственных заболеваний .

Хранение и транспортировка образцов

Для диагностики наследственных заболеваний образцы крови хранятся на специальных бумажных бланках или в эпиндорфах (пластиковых пробирках) в замороженном состоянии в течение длительного времени (рис. 9).

Для диагностики инфекционных заболеваний образцы находятся при комнатной температуре не более 2-х часов. При необходимости более длительного хранения пробы могут быть помещены в холодильник с температурой 2-8°С на срок не более суток. Более продолжительное хранение (до 2-х недель) допустимо в замороженном виде в морозильной камере при температуре минус 20°С. Не допускается повторное замораживание-оттаивание проб.

Если ПЦР-диагностическая лаборатория и процедурный кабинет для забора проб территориально разобщены, то транспортировка проб должна осуществляться в термосах или термоконтейнерах с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортировки инфекционных материалов.

Выделение ДНК из образцов

Широкую распространенность получил метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении лизирующего агента, содержащего раствор гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, многократной отмывки и ресорбции ДНК буферным раствором. В случае обработки сыворотки, плазмы или цельной крови обычно используется метод фенольной экстракции. Метод включает депротеинизацию фенолом/хлороформом с последующим осаждением ДНК (или РНК) этанолом или изопропанолом. Обработка произво­дится в микроцентрифужных пробирках типа «Eppendor P» объемом 1,5 мл. Время обработки составляет 1,5-2 часа (рис.10).

Рис. 10. Выделение ДНК.

Проведение ПЦР

Определенное количество образца из обработанной клинической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку типа «Eppendorf"» объемом 0,2 или 0,5 мл. В эту же пробирку добавляется амплификационная смесь, состоящая из воды, ПЦР-буфера, раствора дНТФ, раствора праймеров и раствора Taq-полимеразы (добавляется в смесь в последнюю очередь). Как правило, объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Затем в каждую пробирку добавляется одна капля минерального масла для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе амплификации. Пробирки переносятся в программируемый термостат (амплификатор), где проводится амплификация в автоматическом режиме по заданной программе (рис. 11).

Рис. 11. Амплификатор « Thermocycler ».

Время проведения реакции в зависимости от заданной программы составляет 2-3 часа. Параллельно с опытными пробами ставятся контрольные: положительный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца вносится контрольный препарат ДНК исследуемого гена. Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК вследствие контаминации и исключить учет ложноположительных результатов.

Регистрация результатов

Амплифицированный специфический фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчи­вое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм. В зависимости от размера образующихся в результате ПЦР ампликонов используют гель с содержанием агарозы от 1,5% до 2,5%. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия. Охлажденную до 50-60°С смесь заливают в форму слоем толщиной 4-6 мм и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. Гребенки устанавливают таким образом, чтобы между дном лунок и основанием геля оставался слой агарозы 0,5-1 мм. После застывания геля в карманы наносится амплификат в количестве 5-15 мкл. Рекомен­дуется параллельно с контрольными и опытными пробами проводить электрофорез смеси маркеров длин фрагментов ДНК. Обычно такая смесь содержит десять фрагментов ДНК длинной 100, 200, 300 и т. д. пар оснований.

Постановка такой пробы позволяет верифицировать длину ампликонов в контрольных и опытных пробах. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером, камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30-45 мин при напряженности электрического поля 10-15 В/см. При этом фронт красителя, входящего в состав реакционной смеси должен пройти не менее 3 см.

После окончания электрофореза гель переносят на стекло трансиллюминатора и просматривают в ультрафиолетовом свете. Для документирования гель фотографируют на пленку типа "Микрат 300" или регистрируют с помощью видеосистемы, соединенной с компьютером.

В первую очередь оценивают контрольные пробы. В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность должна соответствовать указанной в инструкции длине ампликона.

В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие такой полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации - загрязнении используемых реагентов исследуемой ДНК или ампликоном. Опытные пробы оценивают по наличию в соответствующей дорожке полосы, которая располагается на том же уровне, что и полоса в положительной контрольной пробе. Интенсивность свечения полосы соответствует количеству исследуемой ДНК в пробе, что позволяет проводить полуколичественную оценку ПЦР. Обычно положительные результаты оценивают по четырехбальной шкале. Если же свечение полосы в опытной пробе очень слабое, то такую пробу следует переставить (рис. 12).

Рис. 12. Электрофорез в агарозном геле.

Применения ПЦР для диагностики точковых мутаций и полиморфизмов генов

Одним из ведущих направлений применения ПЦР в практическом здравоохранении является диагностика точковых мутаций и полиморфизмов генов. Выделяют прямые и косвенные методы ДНК-диагностики. В тех ситуациях, когда известен ген, повреждение которого приводит к развитию наследственного заболевания, можно это повреждение обнаружить молекулярно – генетическими методами. Такие методы называются прямыми. С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100%.

Однако на практике указанные методы могут применяться при определенных условиях :

· при известной цитогенетической локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания;

· должен быть клонирован ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность.

Целью прямой ДНК-диагностики является идентификация мутантных аллелей.

Таким образом, в тех ситуациях, когда известно, какое именно повреждение ДНК приводит к наследственному заболеванию, исследуется непосредственно фрагмент ДНК, содержащий повреждение, т. е. используется прямой метод ДНК-диагностики.

Однако к настоящему времени гены многих заболеваний не картированы, неизвестна их экзонно-интронная организация и многие наследственные болезни отличаются выраженной генетической гетерогенностью, что не позволяет в полной мере использовать прямые методы ДНК-диагностики. Поэтому в тех случаях, когда локализация повреждения не известна, используется другой подход, связанный с изучением окрестности гена, ответственного за генное заболевание, в сочетании с семейным анализом, то есть используются косвенные методы молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней.

Для выявления точковых мутаций и небольших делеций могут использоваться различные способы, однако все они основаны на использовании метода ПЦР. Данная реакция позволяет многократно умножить нуклеотидную последовательность ДНК, а затем осуществить поиск мутаций. Методы поиска фрагментов ДНК, несущих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных нуклеотидных последовательностей ДНК.

Анализ продуктов ПЦР

в процессе прямой ДНК-диагностики

Предполагает исследование конкретных особенностей амплифицорованного участка гена. Так, при заболеваниях, обусловленных экспансией тринуклеотидных повторов, продукты амплификации различаются по своей длине (отражающей различное число триплетов в изучаемом участке гена) и, как следствие – по их скорости движения в геле. Благодаря этому достигается четкое электрофоретическое разделение нормальных и мутантных аллелей и точное определение патологически удлиненного фрагмента, т. е. ДНК-диагностика болезни (рис. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Рис. 14. Диагностика делеции GAG в гене DYT 1 у больных дофа-независимой дистонией (электрофорез в полиакриламидном геле). Дорожки 2,3,6 – больные; дорожки 1,4,5 – контроль. Тонкой стрелкой обозначен нормальный аллель, жирной стрелкой – мутантный более короткий аллель (делеция трех нуклеотидов).

Если исследуемый участок ДНК целиком входит в состав протяженной делеции, то ПЦР-амплификация ДНК с данного делетированного аллеля осуществляеться не будет в связи с отсутствием мест для гибридизации праймеров. При этом гомозиготная делеция будет диагностирована на основании полного отсутствия ПЦР-продукта реакции (синтез ДНК невозможен с обеих копий гена). При гетерозиготной делеции возможно выявление ПЦР-продукта, синтезированного с нормального (сохранного) аллеля, однако для достоверной диагностики такой мутации необходимо использование более сложных методов визуализации ДНК, позволяющих оценить дозу конечного ПЦР-продукта.

Для выявления точковых мутаций (чаще всего нуклеотидных замен) в определенных сайтах метод ПЦР используется в комбинации с другими методами молекулярно-генетического анализа. Если место локализации и характер предполагаемой точковой мутации точно известны, то для целенаправленного выявления такой мутации могут использоваться рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы ) – особые клеточные ферменты, выделяемые из различных штаммов бактерий.

Данные ферменты распознают специфические нуклеотидные последовательности длиной от четырех до десяти нуклеотидов. После чего осуществляют рестрикцию (лат. (разрезание) этих последовательностей в составе двунитевой молекулы ДНК. Каждая рестриктаза распознает и разрезает в фиксированном месте строго определенную, специфичную для себя нуклеотидную последовательность – сайт рестрикции (сайт узнавания).

В тех случаях, когда точковая мутация изменяет естественный сайт узнавания для определенной рестриктазы, данный фермент не сможет расщепить мутантный амплифицированный в ПЦР фрагмент. В некоторых случаях, мутация приводит к появлению нового сайта узнавания для той или иной рестриктазы, отсутствующего в норме.

В обеих ситуациях мутантный и нормальный ПЦР-продукты, обработанные выбранной рестриктазой, дадут различные по длине фрагменты рестрикции, что можно будет легко обнаружить при электрофорезе (рис. 15).

Таким образом, при необходимости быстрой детекции какой – либо конкретной точковой мутации задача сводится к поиску соответствующей рестриктазы, сайт узнавания которой локализован в месте нарушенной нуклеотидной последовательности. Обработка ПЦР-продуктов такой рестриктазой позволит легко дифференцировать нормальные и мутантные аллели. Рестрикционный анализ значительно упрощает обнаружение известных точковых мутаций и в настоящее время широко используется для прямой ДНК-диагностики наследственных заболеваний.

Заключительным этапом молекулярно-генетического анализа мутаций является определение нуклеотидной последовательности исследуемого фрагмента ДНК (секвенирование), которая сравнивается с нормой и формулируется окончательный генетический диагноз. Благодаря успехам молекулярной генетики в настоящее время разработаны методы ДНК-диагностики более 400 наследственных болезней.

Рис. 15. Выявление точковой мутации с помощью рестрикционного анализа: А – амплифицируемый участок гена, содержащий сайт рестрикции AGCT для рестрикционной эндонуклеазы Alu I . Мутация G → A изменяет данную нуклеотидную последовательность, в результате чего рестрикция ферментом AluI блокируется; Б – электрофореграмма продуктов рестрикции: дорожка 1 – гомозиготность по нормальному аллелю; дорожка 2 – гомозиготность по мутации; дорожка 3 – гетерозиготное состояние (нормальный аллель + мутация).

Диагностика наследственных болезней, основанная на прямом исследовании мутантных аллелей у больных, членов их семей или предполагаемых гетерозиготных носителей патологических мутаций, пригодна для досимптоматической и пренатальной диагностики, которая может быть применена на самых ранних стадиях развития плода, до появления каких-либо клинических или биохимических симптомов болезни.

Независимо от метода детекции мутаций точные молекулярные характеристики каждой мутации могут быть получены только путем прямого секвенирования. Для автоматизации этого процесса в последние годы широко используется специальные аппараты – секвенаторы, которые дают возможность значительно ускорить процесс считывания ДНК-информации.

Путь для более широкого применения молекулярно-биологических исследований в клинико-диагностических лабораториях открывают ускорение аналитического процесса за счет выполнения всех процедур в одном континууме, без переноса пробы, создание условий для предотвращения контаминации при параллельном исследовании ряда аналитов и при объективной регистрации результатов в каждом цикле.

Основные модификации метода ПЦР

Используются для быстрого сканирования и поиска известных генных мутаций.

Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР

Данный метод основан на одновременной амплификации в одной реакции нескольких экзонов исследуемого гена. Это позволяет проводить экономный экспресс-скрининг наиболее частых мутаций. К примеру, для быстрой диагностики носительства делеций в гене дистрофина у больных прогрессирующей мышечной дистрофией Дюшена/Беккера проводится одновременная амплификация набора наиболее часто мутирующих экзонов данного гена. Поскольку эти заболевания наследуются по Х-сцепленному рецессивному типу и связаны с повреждением у мальчиков единственной Х-хромросомы, в случае протяженной делеции при электрофорезе продуктов реакции будет выявлено отсутствие одного или нескольких фрагментов ДНК (экзонов), что может служить молекулярным подтверждением диагноза. Кроме этого, путем подбора для ПЦР-амплификации конкретных участков гена возможна достаточно точная оценка общей протяженности делеции и точек разрыва гена (в плоть до экзона).

Комбинированное использование нескольких мультиплексных реакций позволяет диагностировать до 98% всех делеций, имеющих место у больных прогрессрующей мышечной дистрофией Дюшенна/Беккера. Это составляет приблизительно 60% от общего числа известных мутаций в гене дистрофина и свидетельствует о весьма высокой эффективности данного скринингового метода ДНК-диагностики дистрофинопатий (рис. 16).

Рис. 16. Прямая ДНК-диагностика мышечной дистрофии Дюшенна с помощью мультиплексной ПЦР (электрофорез в агарозном геле). У каждого из обследуемых лиц одновременно амплифицированы четыре экзона гена дистрофина (экзоны 17, 19, 44 и 45; стрелки указывают на соответствующие продукты амплификации). Дорожка 1 – контроль, дорожки 2-5 – больные мышечной дистрофией Дюшенна с различными делециями гена дистрофина (дорожки 2 и 5 – делеция экзона 45, дорожка 3 – делеция экзона 44, дорожка 4 – делеция экзона 17 и 19).

Аллель-специфическая амплификация

Метод основан на использовании двух самостоятельных пар праймеров к конкретному участку гена: один праймер в обеих парах является общим, а второй праймер в каждой паре имеет различную структуру и является комплементарным либо нормальной, либо мутантной последовательности ДНК. В результате такой реакции в растворе одновременно могут синтезироваться две разновидности ПЦР-продуктов – нормальные и мутантные. Причем дизайн используемых праймеров дает возможность четко дифференцировать нормальные и мутантные продукты амплификации по их молекулярному размеру. Данный метод является очень наглядным и позволяет верифицировать как гомо-, так и гетерозиготное носительство мутантного аллеля.

Метод сайт-направленной модификации амплифицированной ДНК

Метод основан на использовании в ПЦР так называемого mismatch-праймера (не полностью комплементарного матрице), который отличается от матричной ДНК-последовательности на один нуклеотид. В результате включения указанного праймера в состав мутантного ПЦР-продукта в нем образуется искусственно созданный сайт рестрикции для одной из рестрикционных эндонуклеаз, что позволяет провести прямую ДНК-диагностику определенной известной мутации с помощью рестрикционного анализа. Создание такого искусственного сайта рестрикции бывает необходимо в том случае, если проведенный поиск не выявил существование известного и доступного фермента, «естественный» сайт рестрикции которого затрагивается в результате появления в молекуле ДНК исследуемой мутации.

Метод обратно-транскриптазной ПЦР (RT - PCR )

Данный метод используется в тех случаях, когда в качестве объекта исследования удобнее использовать не генномную ДНК, а более компактную и информационно «насыщенную» кДНК, получаемую после соответствующей обработки образцов тканей, например биопсийного материала или клеточных линий лимфоцитов, фибробластов и т. д. Важным условие здесь является экспрессия (хотя бы минимальная) нужного гена в исследуемой ткани.

На первом этапе проводится обратная транскрипция мРНК, и получаемые молекулы кДНК служат матрицей для ПЦР. В последующем амплифицированный в достаточном количестве критический участок кДНК подвергается секвенированию и другим методам мутационного скрининга, прямому электорофоретическому исследованию (выявление делеций, вставок и т. д.) либо встраиванию в экспрессионную систему с целью получения белкового продукта и его непосредственного анализа.

Данный метод особенно эффективен для детекции мутаций, ведущих к синтезу «усеченного» белка (нонсенс-мутации, мутации сплайсинга, крупные делеции) – так называемый РТТ-анализ (Protein Truncation Test). РТТ-анализ обычно используется при исследовании протяженных мультиэкзонных генов, таких как ген мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера, атаксии-телеангиоэктазии или нейрофиброматоза 1 типа.

ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR, англ.)

С каждым годом в практическом здравоохранении ПЦР в реальном времени становится все более востребованным методом диагностики. Его принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация, и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК этот метод в последние годы успешно применяется в крупнейших санитарно-эпидемических, диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира, замещая ПЦР в ее сегодняшнем ("классическом") формате.

ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способен детектировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

Рис. 17. ПЦР в реальном времени.

ПЦР в реальном времени использует TaqMan систему, контролирующую кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции. Для детекции используется зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5"-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата (рис. 17).

Основные преимущества ПЦР-Real-Time перед ПЦР с гель электрофорезом :

· Весь метод проходит в одной пробирке;

· Проведение метода занимает 1 час;

· Достаточно 1-2 рабочих комнат;

· Наряду с качественной оценкой результата появляется возможность количественной оценки (например, при назначении противовирусной терапии при СПИДе или вирусных гепатитах необходимо знать вирусную нагрузку, т. е. количество вируса на 1ед., что обеспечивает ПЦР real time);

· Резко снижается риск контаминации.

Заключение

Метод ПЦР является одним из наиболее распространенных методов молекулярно-биологических исследований. Данный метод должен применяться клиницистами осмысленно, и врач, решивший использовать ПЦР в своей, работе должен обладать определенными знаниями об особенностях и возможностях данного метода. Во-вторых, между клиницистом и ПЦР-лабораторией должна существовать тесная обратная связь, необходимая для анализа сложных слу­чаев и выработки правильной диагностической стратегии. В-третьих, ПЦР-анализ не является пана­цеей в диагностике (прежде всего инфекционных заболеваний) и не заменяет существующие методы исследований, а лишь дополняет их. И главное - ПЦР не может заменить интуицию и аналитическое мышление, которыми должен обла­дать врач, рассчитывающий на успех.

P . S . Молекулярно-биологические исследования - смена ориентиров диагностики и лечения. С применением молекулярно-биологических методов связывают перспективу радикальной смены акцентов в лабораторной диагностике. Речь может идти не просто о своевременной информации, а об ее заблаговременном получении. Если сейчас лабораторные исследования в большинстве случаев проводятся уже при развившейся болезни и начатом лечении, то молекулярно-биологическая лабораторная информация, как ожидают, даст возможность выявить наклонность человека к некоторым видам патологии и степень чувствительности к некоторым лекарствам, что позволит обосновать предсказательный, профилактический и персонализированный характер медицины будущего.

СМЕНА ОРИЕНТИРОВ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Сегодня В будущем

Диагноз Генетический паспорт

8. Сколько рабочих комнат необходимо для работы ПЦР-лаборатории с флуоресцентной детекцией (количественный анализ, Real-Time PCR)?

9. Что такое детекция?

10. Какие методы ДНК-диагностики выделяют?

11. Работа какого фермента лежит в основе ПЦР?

12. Почему зону детекции необходимо удалять от других рабочих зон?

13. Что такое сайт рестрикции?

14. В чем отличия прямого метода ДНК-диагностики от косвенного?

15. Что такое секвенирование?

16. Что такое мультиплексная ПЦР?

17. Какие типы мутаций определяют при помощи ПЦР?

18. Что такое контаминация?

19. В чем заключается сущность метода аллель-специфической амплификации?

20. Условия хранения материала для ПЦР?

21. В каком приборе проходит амплификация?

22. В чем заключается метод обратно-транскриптазной ПЦР (RT-PCR)?

23. Что служит материалом для ПЦР-диагностики?

24. Перечислите виды контаминации?

Тесты для самоподготовки

1. Эндонуклеазные рестриктазы:

а) ферменты, «разрывающие» ДНК в строго специфических местах;

б) ферменты, сшивающие разрывы молекулы ДНК;

в) ферменты, обеспечивающие соединения, осуществляющие репарацию ДНК.

2. Амплификация генов:

3. Какой из методов молекулярной генетики применяется для диагностики болезней, обусловленных мутантным геном известной последовательности?

а) использование специфичной рестриктазы;

б) прямая детекция с использованием специфичных молекулярных зондов;

в) семейный анализ распределения нормального полиморфизма длины рестрикционных фрагментов.

4. Секвенирование ДНК:

а) идентификация последовательности оснований ДНК;

б) многократное повторение какого-либо участка ДНК;

в) выделение фрагмента ДНК, содержащего изучаемый ген.

5. Для получения образцов ДНК можно использовать :

б) ворсины хориона;

в) амниотическую жидкость;

г) клетки амниотической жидкости;

д) биоптаты кожи, мышц, печени,

е) все верно, кроме пункта «в»,

ж) все верно, кроме пункта «г»,

з) все вышеперечисленное верно.

6. Для диагностики каких мутаций применяется метод ПЦР:

а) геномные;

б) хромосомные;

в) генные (точечные).

7. Праймер это:

а) комплементарный участок ДНК;

б) синтетическая олигонуклеотидная меченая (радиоактивно или флюоресцентно) последовательность, комплементарная мутантному или нормальному гену;

в) олигонуклеотид, выполняющий роль «затравки» и инициирующий синтез полинуклеотидной цепи на ДНК- или РНК - матрице.

8. Кем был разработан принцип метода ПЦР?

б) К. Мюллис

9. Применяется ли метод ПЦР для диагностики экспансии тринуклеотидных повторов (динамического типа мутаций)?

10. В каких областях применяется ПЦР?

а) клиническая медицина;

б) определение трансгенных организмов (ГМО)

в) идентификация личности, установление отцовства, криминалистика

г) все вышеперечисленное,

д) ничего из вышеперечисленного..

Эталоны ответов: 1 – а; 2 – б; 3 – б; 4 – а; 5 – е; 6 – в; 7 – в; 8 – б; 9 – а, 10 – г.

Основная

1.Бочков генетика. Москва. ГЭОТАР, 2002.

Дополнительная

1. , Бахарев и лечение врожденных и наследственных заболеваний у детей. – Москва, 2004.

2. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование. – Москва, 2004.

3. Гинтер генетика. – Москва, 2003.

4. Горбунов основы медицинской генетики. – СПб.: Интермедика, 1999.

5. Дж. Макги. Молекулярная клиническая диагностика. – Мир, 1999.

6. Меньшиков -биологические исследования в клинической лабораторной диагностике: возможности проблемы (лекции). Клиническая лабораторная диагностика, № 3, 2006.

7. Корниенко работы ПЦР-лаборатории при поточном анализе биологического материала. Клиническая лабораторная диагностика, № 10, 2006.

8. Организация работы ПЦР-лаборатории. Методические указания. МУ 1.3.1794-03. Главный санитарный врач РФ, 2003.

9. Erlich H. A. PCR technology. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Real time quantitative PCR. Genome Res. – № 6, 1996.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Методическое пособие для внеаудиторной работы студентов 3-4 курсов по специальностям лечебное дело (060101) и педиатрия (060103).

ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Россия, Красноярск,

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, который представляет собой специфическую амплификацию нуклеиновых кислот, индуцируемую синтетическими олигонуклеотидными праймерами in vitro.

Идея разработки метода ПЦР принадлежит американскому исследователю Kary Mullis, который в 1983 г. создал метод, позволивший амплифицировать ДНК в ходе циклических удвоений с помощью фермента ДНК-полимеразы в искусственных условиях. Через несколько лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., К. Mullis получил за нее Нобелевскую премию.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания- охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 г. ее существенно модифицировали за счет использования ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты способны выдерживать множество циклов реакции, что позволяет автоматизировать проведение ПЦР. Одна из наиболее часто использовавшихся термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq -ДНК-полимеразой.

Суть метода. Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи фермента Taq- ДНК-полимеразы. Полимеразная цепная реакция позволяет получить амплификаты длиной до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для увеличения длины ПЦР-продукта до 20-40 тыс. пар нуклеотидов применяют смесь различных полимераз, но все равно это значительно меньше длины хромосомной ДНК эукаротической клетки.

Реакция проводится в программируемом термостате (амплификаторе) - приборе, который может проводить достаточно быстро

охлаждение и нагревание пробирок (обычно с точностью не менее 0,1 °С). Амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта» и последующего хранения. Для ПЦР в режиме реального времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-45 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурации, отжига праймеров, элонгации (рис. 6.1 и 6.2). На рис. 6.1 представлена динамика изменения температуры в пробирке при проведении цикла ПЦР.

Рис. 6.1. График изменения температуры в пробирке в течение одного цикла полимеразной цепной реакции

Денатурация ДНК-матрицы проводится с помощью нагревания реакционной смеси до 94-96 °С на 5-90 с, чтобы цепи ДНК разошлись. Следует отметить, что перед первым циклом осуществляют предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 мин для полной денатурации исходной матрицы, что позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Рис. 6.2. Схема первого цикла полимеразной цепной реакции

Стадия отжига праймеров. При плавном снижении температуры праймеры комплементарно связываются с матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно она на 4-5° ниже расчетной температуры плавления. Длительность стадии - 5-60 с.

Во время следующей стадии - элонгации - происходит синтез дочерней цепи ДНК на матрице материнской. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые ДНК-полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °С. Время элонгации, в основном зависящее от длины ПЦР-продукта, обычно составляет 1 мин на каждую тысячу пар оснований.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR - polymerase chain reaction) - метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце.

Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro . Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям. Синонимом процесса копирования ДНК является «амплификация». Репликация ДНК in vivo также может считаться амплификацией. Однако в отличие от репликации, в процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются короткие участки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидов).

Основные принципы

Итак, ПЦР - это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного температурного цикла?

Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают "праймеры" (затравки) - синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК - двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами. Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом:

1. денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) - 95°С - 1 или 2 минуты;
2. отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии определяется нуклеотидным составом праймера) - 60°С (к примеру) - 1 минута;
3. элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) - 72°С - 1 минута (время зависит от длины синтезируемого фрагмента).

Приборная база для применения метода полимеразной цепной реакции в лаборатории должна состоять из:

1. (или, как его еще называют, термоциклера);
2. системы для с (для визуализации результатов ПЦР);
3. системы (для анализа результатов ПЦР);
4. (для пробоподготовки);
5. набора (механических или электронных).

Помимо основного и вспомогательного оборудования для полноценного функционирования ПЦР-лаборатории, необходимы некоторые расходные материалы: стерильные наконечники, пробирки, штативы для пробирок и дозаторов.

Реагентная база в обычной ПЦР-лаборатории для проведения полноценной полимеразной цепной реакции включает в себя фермент ДНК-полимеразу с буфером, праймеры (небольшие синтетические фрагменты ДНК, комплементарные началу и концу анализируемого участка ДНК-матрицы), смесь нуклеотидов (А, Т, Г, Ц). Также абсолютно необходима очищенная вода.

Достоинства метода ПЦР

Высокая чувствительность исследования

Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 10 5 клеток.

Специфичность анализа

ПЦР позволяет выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. Специфически подбирая компоненты реакции (праймеры), Вы можете одновременно выявлять ДНК близкородственных микроорганизмов.

Универсальность метода ПЦР

Дело в том, что для ПЦР-диагностики инфекционных заболеваний, либо наследственных заболеваний человека можно использовать одно и то же оборудование, следовать универсальным процедурам подготовки образцов (проб) и постановки анализа, а также однотипные наборы реактивов.

Экономия времени

Важное преимущество ПЦР - отсутствие стадий культуральной микробиологической работы. Подготовка образцов, проведение реакции и анализ результатов максимально облегчен и во многом автоматизирован. Благодаря этому, время получения результата может сокращаться до 4-5 часов.

Эффективность метода ПЦР

Широта исследуемого клинического материала

В качестве образца при полимеразной цепной реакции может быть использован не только биологический материал от больного, но также и многие другие субстраты, в которых могут быть идентифицированы молекулы ДНК с высокой чувствительностью, например, вода, почва, продукты питания, микроорганизмы, смывы и многое другое.

Все перечисленные выше достоинства этого уникального метода - высокая чувствительность и специфичность, идентификация инфекционного агента и проведение генотипирования любого гена человека, высокая эффективность и экономия времени, универсальность приборной базы - позволяют широко применять сегодня метод ПЦР в клинической диагностике, медицинской практике, научных исследованиях, контроле качества и многих других областях.

Применение ПЦР

Области применения полимеразной цепной реакции как современного метода молекулярной биологии разнообразны. Во многом это обусловлено широтой материала, который можно анализировать (практически все, из чего можно выделить более-менее качественую ДНК может стать объектом исследования), а также подобранных праймеров. Основные области применения ПЦР:

клиническая медицина

• диагностика инфекционных заболеваний
• диагностика наследственных заболеваний
• выявление мутаций
• генотипирование
• клеточные технологии
• создание генетических паспортов

экология

• мониторинг состояния окружающей среды
• анализ продуктов питания
• анализ генетически-модифицированных организмов (ГМО)

судебная медицина и криминалистика

• идентификация личности
• установление отцовства

фармакология

ветеринария

научные исследования (молекулярная биология, генетика)

Организация лаборатории ПЦР

Информация для заказа

Наименование	Объем	Производство	Метод	Кат.Номер

Получил Нобелевскую премию .

В начале использования метода после каждого цикла нагревания-охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу , так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий . Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq -полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3"→5" экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo , выделенные из архей , обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq . Сейчас применяют смеси Taq и Pfu , чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

В момент изобретения метода Кэри Муллис работал химиком-синтетиком (он синтезировал олигонуклеотиды, которые применялись тогда для выявления точечных мутаций методом гибридизации с геномной ДНК) в компании Цетус (Cetus Corporation), которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование Taq -полимеразы компании Хофман-Ла Рош за 300 млн долларов. Однако оказалось, что Taq -полимераза была охарактеризована советскими биохимиками А. Калединым, А. Слюсаренко и С.Городецким в 1980 году , а также за 4 года до этой советской публикации, то есть в 1976 году, американскими биохимиками Alice Chien, David B.Edgar и John M. Trela. В связи с этим компания Промега (Promega) пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент . Американский патент на метод ПЦР истёк в марте 2005 г.

Проведение ПЦР

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro ). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК . В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp ). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований .

Компоненты реакции

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

• ДНК-матрица , содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать .
• Два праймера , комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
• Термостабильная ДНК-полимераза - фермент , который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов - Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
• Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Ионы Mg 2+ , необходимые для работы полимеразы.
• Буферный раствор , обеспечивающий необходимые условия реакции - рН , ионную силу раствора . Содержит соли, бычий сывороточный альбумин .

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата , побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата . Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию .

Праймеры

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами , короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18-30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг ), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ).

Важнейшая характеристика праймеров - температура плавления (T m) комплекса праймер-матрица.

T m - температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Усредненная формула подсчета T m для короткого олигонуклеотида (и для длинных ДНК фрагментов), с учетом концентрации ионов K + и DMSO :

где L - количество нуклеотидов в праймере, K + - молярная концентрация ионов калия, G+C - сумма всех гуанинов и цитозинов .

В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

Амплификатор

Рис. 1 : Амплификатор для проведения ПЦР

ПЦР проводят в амплификаторе - приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Ход реакции

Фотография геля, содержащего маркерную ДНК (первый и последний слоты) и продукты ПЦР

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий (рис. 2).

Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94-96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5-2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией , так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-3 мин для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом , он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом . Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига - 30 cек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60-72 °C.

Элонгация

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это - стадия элонгации . Полимераза начинает синтез второй цепи от 3"-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5" к 3" концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации , чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.

Рис. 2 : Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94-96 °C. (2) Отжиг при 68 °C (например). (3) Элонгация при 72 °C (P=полимераза). (4) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2 n - 2n, где n - число циклов реакции . На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1+E) n , где P - количество продукта, Е - средняя эффективность цикла.

Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов , образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

Разновидности ПЦР

• Вложенная ПЦР (Nested PCR (англ.) ) - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
• Инвертированная ПЦР (Inverse PCR (англ.) ) - используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
• ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.) ) - используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК , которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.
• Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR ) - проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Модификаций этого метода является англ. Linear- After- The- Exponential-PCR (LATE-PCR), в котором используются праймеры с разной концентрацией, и праймер с низкой концентрацией подбирается с высокой (температурой плавления), чем праймер с высокой концентрацией. ПЦР проводят при высокой температуре отжига, тем самым удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов .
• Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.) ) или ПЦР в реальном времени - используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют флуоресцентно-меченые праймеры или ДНК-зонды для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления; или используется флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green I , который связывается с двухцепочечной ДНК. Sybr Green I обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. В ходе амплификации краситель SYBR Green I встраивается в малую бороздку ДНК ПЦР продуктов и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал при облучении синим лазером. SYBR Green I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения - при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный) .
• Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.) ) - с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев, первые десять ПЦР циклов, можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например до 60-65°С.
• Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Colony - PCR Colony ) - акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.
• ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR ).
• ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR ) - модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз, одна из которых - Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая - ДНК полимераза с 3"-5" экзонуклеазной активностью, обычно это Pfu полимераза. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой, так как Taq-полимераза останавливает синтез ДНК если был добавлен не комплементарный нуклеотид. Этот не комплементарный нуклеотид удаляет Pfu полимераза. Смесь полимераз берется в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где Taq-полимераза берётся в 25-100 раз больше по отношению к Pfu полимеразе.
• RAPD (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA ), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК - используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.
• Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR ) - ПЦР для родственных последовательностях внутри одного или между разными видами , используя консервативные праймеры к этим последовательностям. Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным 18S и 26S генам для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов 18S и 26S консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов. Противоположный этому методу является - уникальная ПЦР (англ. unique PCR ), в котором задача состоит в подборе праймеров для амплификации только конкретной последовательности среди родственных последовательностей.
• ПЦР с использованием горячего старта (англ. Hot-start PCR ) - модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующие антитела небольшими молекулами типа Affibody , то есть в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР. Обычно первая денатурация проводится при 95 °C в течение 10 минут.
• Виртуальная ПЦР (англ. in silico PCR , цифровая ПЦР, электронная ПЦР, е-ПЦР) - математический метод компьютерного анализа теоретической полимеразной цепной реакции c использованием списка последовательностей праймеров (или ДНК-зондов) для предсказания потенциальной амплификации ДНК исследуемого генома , хромосомы , кольцевой ДНК или любого другого участка ДНК.

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры , последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: …ATH… , где Н - А, Т или С.

Применение ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

Криминалистика

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления - кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически - одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint ).

Установление отцовства

Рис. 3 : Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) Отец. (2) Ребёнок. (3) Мать. Ребёнок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.

Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков (рис. 3). Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Медицинская диагностика

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций . Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

Персонализированная медицина

Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого - отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого - менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства. Такой анализ называют предварительным генотипированием (англ. prospective genotyping ).

Клонирование генов

Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) - это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций , получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор - фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена - РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

Рис. 4 : Клонирование гена с использованием плазмиды.
(1) Хромосомная ДНК организма A. (2) ПЦР. (3) Множество копий гена организма А. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида с геном организма А. (6) Введение плазмиды в организм В. (7) Умножение количества копий гена организма А в организме В.

Секвенирование ДНК

В методе секвенирования с использованием меченных флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченные флуоресцентной или радиоактивной меткой. Присоединение дидезоксинуклеотида к синтезируемой цепи приводит к обрыву синтеза, позволяя определить положение специфических нуклеотидов после разделения в геле.

Мутагенез

В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

Часто используется в качестве экспресс-метода для индикации и идентификации вирусов.

Впервые этот метод разработал К. Мюллис (США) в 1983 т. Благодаря высокой чувствительности, специфичности и простоте выполнения его широко применяют в генетике, судебной медицине, диагностике и других областях.

Суть метода - амплификация, т. е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro. В этом методе действуют матричный механизм и принцип комплементарности. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновой кислоты) способны связываться водородными связями в одну двуспиральную, если последовательности нуклеотидов одной точно соответствуют последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары аденин-тимин и гуанин-цитозин.

ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймер - это фрагмент ДНК, состоящий из 20-30 нуклеотидов. Эти праймеры (затравки) комплементарны противоположным цепям ДНК. При синтезе ДНК праймеры встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК.

Обычно ПЦР ставят в 25-40 циклов. Каждый цикл включает три этапа: первый - денатурация при 92-95 °С. При этом две цепи ДНК расходятся; второй - отжиг, или присоединение праймеров при 50-65 °С; третий - элонгация, или полимеризация при 68-72 °С, при этом ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание цепей ДНК-матрицы с помощью четырех видов нуклеотидов. В результате одного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. Образовавшиеся в первом цикле цепи ДНК служат матрицами для второго цикла и т. д. После первого цикла амплифицируется только фрагмент между двумя праймерами. Таким образом, идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов насинтезировать миллионы (2 n) фрагментов ДНК - количество, достаточное для индикации их различными методами (методом гибридизационных зондов, содержащих определенную метку, электрофорезом и т. д.). Чаще для этой цели используют метод электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

В ПЦР из участков ДНК возбудителя используют праймеры, которые имеют уникальную последовательность нуклеотидов, характерных только для определенного возбудителя.

Методика постановки ПЦР сводится к следующему: из исследуемого материала выделяют ДНК-матрицу; в пробирке соединяют выделенную ДНК с амплификационной смесью, в которую входят ДНК-полимераза, все 4 вида нуклеотидов, 2 вида праймеров, MgCl, буфер, деионизированная вода и минеральное масло. Затем пробирки помещают в амплификатор, и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду возбудителя. Результаты регистрируют чаще методом электрофореза в 1-2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ-лучами на трансиллюминаторе. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня.

С целью повышения специфичности и чувствительности ПЦР применяют различные варианты: гнездовую ПЦР; ПЦР с «горячим стартом» с использованием парафиновой прослойки или блокады активных центров полимеразы моноклональными антителами. Кроме того, некоторые фирмы выпускают лиофилизированные наборы реагентов для проведения амплификации ДНК, которые позволяют ускорить процесс проведения ПЦР и уменьшить возможность появления ложноположительных результатов.

В настоящее время внедряется новая технология ПЦР-ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальная особенность - мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить предъявляемые к ПЦР требования лаборатории. ПЦР в реальном времени используют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способа детективировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

Система детекции продукта в полимеразной цепной реакции «real-time» (мониторинговая ПЦР) позволяет цикл за циклом следить за накоплением амплифицированной ДНК. Система включает и себя олигонуклеотидный зонд, который способен присоединяться (гибридизироваться) к внутреннему сегменту ДНК-мишени. На 5′-конце зонд помечен флуоресцентным красителем-репортером (reporter dye), а на 3′-конце - блокатором (quencher dye). По мере накопления продукта ПЦР зонд гибридизируется к нему, однако свечения не происходит из-за близости между репортером и блокатором. В результате копирования последовательности полимераза достигает 5′-конца зонда. 5’-3′-экзонуклеазная активность полимеразы отсоединяет флуоресцентную метку с 3′-конца пробы, тем самым освобождая флуоресцирующий репортер от его связи с блокатором сигнала, что и приводит к увеличению флуоресценции. Уровень флуоресценции, таким образом, пропорционален количеству специфичного продукта реакции. Важно, что результаты ПЦР регистрируются по наличию флуоресценции в закрытых пробирках и, таким образом, решается еще одна из основных проблем этого метода - проблема контаминации ампликонами.

Достоинства ПЦР: быстрота анализа; высокие чувствительность и специфичность; минимальное количество исследуемого материала; простота в исполнении и возможность полной автоматизации.

Ввиду того что чувствительность ПЦР может достигать до детекции одной копии ДНК-матрицы, существует высокая степень опасности получения ложноположительных результатов. Поэтому генно-диагностической лабораторией при постановке ПЦР необходимо неуклонно выполнять специальные требования к планировке и режиму работы.

ПЦР является одним из дополняющих методов, существующих в вирусологической диагностике. Эта реакция очень важна для диагностики вирусных инфекций, когда вирусные антигены или вирусспецифические антитела не могут быть обнаружены и когда присутствие вирусной нуклеиновой кислоты может быть единственным свидетельством заражения, особенно при латентно протекающих и смешанных инфекциях.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .