Применение риф. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), или метод флуоресцирующих антител (МФА)

Реакция основана на том, что иммунные сыворотки обрабатывают флюорохромами (ФИТЦ), которые соединяются с антителами. Сыворотки при этом не теряют своей иммунной специфичности. При взаимодействии полученной люминесцентной сыворотки с соответствующим антигеном образуется специфический светящийся комплекс, легко видимый в люминесцентном микроскопе.

Различные иммунофлюоресцентные сыворотки могут быть использованы для прямого и непрямого метода иммунофлюоресценции. При прямом методе специфические флюоресцирующие иммунные сыворотки готовят для каждого микроба путем иммунизации кролика убитой культурой возбудителя, затем иммунную сыворотку кролика соединяют с флюорохромом (изоционат или изо-тиоционат флюоресцеина). Метод применяется для экспресс-диагностики с целью обнаружения бактериальных или вирусных антигенов.

Непрямой метод предусматривает использование диагностической иммунной не флюоресцирующей сыворотки (иммунизированного кролика или больного человека) и флюоресцирующей сыворотки, имеющей антитела против видовых глобулинов диагностической сыворотки.

Работа № 3

Иммуноферментный анализ (ифа)

Широкое применение находит твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Он основан на том, что белки прочно адсорбируются на пластинках, например из поливинилхлорида. Один из наиболее распространенных на практике вариантов ИФА основан на использовании меченных ферментом специфических антител той же специфичности. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор с анализируемым антигеном. В процессе инкубации на твердой фазе образуются специфические комплексы антиген-антитело. Затем носитель отмывают от не связавшихся компонентов и добавляют гомологичные антитела, меченные ферментом, которые связываются со свободными валентностями антигена в составе комплексов. После вторичной инкубации и удаления избытка этих меченных ферментом антител определяют ферментативную активность на носителе, величина которой будет пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

При другом варианте ИФА к иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и удаления не связавшихся компонентов с помощью меченных ферментом антиглобулиновых антител выявляют специфические иммунокомплексы. Данная схема является одной из наиболее распространенных при постановке ИФА.

Специфические Исследуемый материал- Специфические антитела Субстрат

антитела возбудитель с пероксидазой для пероксидазы

Исследуемая АГС, меченая

сыворотка пероксидазой Субстрат для

Специфический пероксидазы

Контроль:

позитивный - иммунная сыворотка, меченная пероксидазой + субстрат - 2 лунки;

негативный - нормальная сыворотка + субстрат - 2 лунки.

№ 35 Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение.
Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.
Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.
Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
Механизм . На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген - антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген - антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген - антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген - антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

22. Иммуноферментный анализ - лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакции антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Классификация:

Конкурентный (в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог)

Неконкурентный (Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела))

Прямой и непрямой

1.сыворотку,содержащую смесь ат, инкубируют с аг, фиксированным на твердом субстрате.

2.ат,не связывающие аг, удаляют многократным промыванием.

3. вносят меченную ферментом антисыворотку к ат, связывавшим аг

4.определят количество фермента-маркера, связавшегося с ат

Непрямой:

Ат-положительная сыворотка

1.специфические ат в иследуемой сыворотке связывают аг, фиксированный на твердом субстрате

2. специфичные ат, меченные ферментом,не взаимодействуют со связанным аг-содержание маркера в субстрате низкое

Ат-отрицательная сыворотка

1. Неспецифические ат в исследуемой сыворотке не связывают аг, фиксированный на твердом субстрате

2. Специфические ат, меченные ферментом, взаимодействуют, с фиксированным аг –содержание маркера высокое

Наиболее распространен твердофазный ифа, при котором один из компонентов иммунной реакции(антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. В качестве твердого носителя используется микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови, меченную ферментом, и смесь растворов для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена.

Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем-смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

Применение: для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями.

23. Серологическая реакция - реакция, с помощью которой исследуется реакция антигена (микроба, вируса, чужеродного белка) с антителами сыворотки крови.

Серологические исследования - это методы изучения определенных антител или антигенов в сыворотке крови больных, основанные на реакциях иммунитета. С их помощью также выявляют антигены микробов или тканей с целью их идентификации.

Обнаружение в сыворотке крови больного антител к возбудителю инфекции или соответствующего антигена позволяет установить причину заболевания.

Серологические исследования применяют также для определения антигенов групп крови, тканевых антигенов и уровня гуморального звена иммунитета.

Серологические исследования включают в себя различные серологические реакции:

1. Реакция агглютинации.

2. Реакция преципитации.

3. Реакция нейтрализации.

4. Реакция с участием комплемента.

5. Реакция с использованием меченых антител или антигенов.

Открытая еще в 1942 году Кунсом, реакция иммунофлуоресценции не является новым методом исследования. Однако появление гибридомных технологий, которые позволили получить моноклональные антитела, дало «вторую жизнь» этой реакции, поскольку их использование позволило в несколько раз увеличить чувствительность данной реакции и ее специфичность.

И сегодня мы расскажем вам в подробностях про реакцию прямой и непрямой иммунофлуоресценции (РИФ) как метод диагностики Кунса для взрослых мужчин и женщин при беременности.

Что такое реакция иммунофлуоресценции

Представляя собой отличную возможность для быстрого получения точного диагноза, реакция иммунофлуоресценции позволяет определить наличие возбудителя заболевания в патологическом материале. Для этого применяется мазок из материала, который специальным образом обрабатывается с помощью меченого ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианатом), и изучается в качестве гетерогенного анализа.

Для получения результата применяется люминесцентного микроскопа, в его оптической системе находится набор светофильтров для обеспечения препарата сине-фиолетовым либо ультрафиолетовым светом, имеющий заданную длину волны. Данное условие позволяет флюорохром отсвечивать при заданном диапазоне. Исследователем оцениваются свойства свечения, его характер, размеры объектов и их взаиморасположение.

Кому ее назначают

Проведение реакции иммунофлуоресценции может назначаться при диагностике множества вирусных заболеваний. В частности, ее назначают при комплексном обследовании на выявление следующих факторов:

наличие в организме вируса ;
заражение сальмонеллой;
существование в организме определенных антигенов;
выявляется вероятность заражения организма хламидиями, микоплазмами и другими микроорганизмами, имеющими способность к возбуждения вирусных заболеваний человека;
диагностика вирусных болезней у животных.

Перечисленные показания позволяют использовать реакцию иммунофлуоресценции при выявлении в организме человека и животных вирусных заболевания различной природы.

Цели проведения

Поскольку данный метод диагностики имеет множество преимуществ, к которым следует отнести его высокую результативность, быстроту проведения и получения результата, а также отсутствие большого количества противопоказаний, с его помощью определяется наличие в организм вирусных инфекций. Поэтому назначать данный анализ могут как для постановки, так и для уточнения диагноза, на основании которого назначается схема лечения.

Проведение процедуры не вызывает неприятных ощущений, для нее необходимо получить материал для анализа, который берется из любой жидкости организма: слюны, мокроты, соскоб с поверхности слизистых оболочек. Также может для проведения анализа браться кровь. Частоту проведения реакции иммунофлуорсценции назначает лечащий врач, которому необходимо получить данные по динамике протекающих в организме процессов.

Поскольку вреда как для организма, так и для общего самочувствия человека данный анализ не несет, назначаться он может по необходимости.

Виды такой процедуры

Сегодня применяется несколько разновидностей данного анализа, каждый из которых имеет ряд специфических особенностей и позволяет получить максимально развернутую картину процессов, происходящих в организме.

К разновидностям реакции иммунофлуоресценции следует отнести:

— один из наиболее бурно развивающихся видов диагностики, этот анализ дает возможность получения количественных данных без применения серийных разведений. Благодаря использованию полученных измерений оптической плотности жидкости получается точно определить уровень концентрации нужного компонента. Широкие возможности данного вида анализа используются при использовании для его осуществления моноклональных антител, что позволяет определить фазу инфекционного процесса, его остроту;
ДНК-диагностика — данный метод основан на комплементарном связывании нуклеотидов, для чего могут использоваться такие жидкости, как слюна, кровь, ликвор, моча, мокрота, биоптаты, кровь. Данный метод наиболее эффективно позволяет выявить наличие в организме вирусов папилломы, однако многие современные тест-системы могут изредка давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Причиной их может быть загрязнения проб жидкости для проведения анализа специфической ДНК, наличие которой может иметь гнездный или тотальный характер;
иммунохромотография — специфика этого способа определения наличия в организме патологической среды и вирусов состоит в применении в ходе реакции меченых антител. Используется данный метод диагностики для выявления и степени активности процесса заражения стрептококками группы А, а также хламидиями следующих видов: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia фирмы Oxoid. Обладая максимально высокой чувствительностью, тест-системы, которые основаны на данной методике исследования. применяются обычно как ориентировочный тест.

Перечисленные разновидности имеют особенности проведения и специфические характеристики результатов, однако все они направлены на получение данных о наличии в организме патологических микроорганизмов и вирусов, а также о степени их размножения и активности.

Показания к проведению

Реакция иммунофлуоресценции может назначаться для выявления в организме любого вида патологической среды.

Хламидии, трихомонады, гонококки и , а также лямблии всех видов определяются при проведении данного вида диагностики. и , и другие болезни также требуют проведения РИФ. Назначение врача для ее осуществления обязательно.

Противопоказания для проведения

Поскольку для проведения данной реакции в качестве исследуемого материала требуется любой вид жидкости организма, взятие их обычно не составляет трудностей и противопоказаний для осуществления реакции иммунофлуоресценции не существует. Однако при беременности и у детей до 6 месяцев взятие материала для исследования проводится с максимальными предосторожностями.

Отсутствие противопоказаний позволяет осуществлять проведение данного вида диагностики при назначении врача всем пациентам. Безопасность ее гарантируется использованием дезинфицированным инструментом и одноразовыми шприцами.

Подготовка к процедуре

Особенностей взятия материала для проведения данного анализа не существует. Кровь для него берется натощак, чтобы не было повышенного содержания в ней веществ, которые может изменить истинные показания и дать ложную картину.

Как проходит забор анализов

Поскольку особой подготовки для проведения анализа не требуется, исключается только прием пищи за 12 часов до ее проведения и отсутствие применения лекарственных препаратов, выполняется взятие исследуемого материала как обычный процесс взятия жидкости организма на анализ.

Субъективные ощущения во время процедуры могут различаться в зависимости от чувствительности.

Расшифровка результатов

Применение современных тест-систем позволяет получать максимально точные результаты анализа. Для расшифровки результата применяются следующие данные:

степень интенсивности флюоресценции;
оттенок флюоресценции;
периферический характер процесса свечения объекта;
характеристики морфологии, расположения возбудителя во взятом мазке исследуемого материала и его размеры.

Во время исследования объектов, имеющих крупные размеры (например, гарденереллы, трихомонады, клетки, которые уже поражены вирусами), перечисленные выше критерии дают возможность получения максимально достоверных результатов. Однако элементарные тела микоплазмы и хламидий обладают размерами, лежащими на пределе разрешающих способностей люминесцентного микроскопа, что затруд

няет получение точного результата, поскольку периферическое свечение теряет часть своей интенсивности. Оставшиеся критерии уже недостаточны для точной идентификации исследуемых микроорганизмов. По этой причине особые требования предъявляются к специалистам, которые проводят данный вид исследования: уровень их квалификации должен быть достаточным для оперирования имеющимися данными.

По этой причине расшифровкой полученного анализа может заниматься только врач с соответствующим уровнем квалификации. Про цену на исследование методом РИФ читайте ниже.

Средняя стоимость

Цена проведения реакции иммунофлуоресценции зависит от места ее проведения и уровня медицинского учреждения,а также квалификации проводящего анализ специалиста. Сегодня стоимость колеблется от 1280 до 2 160 рублей.

Более подробно о иммунологических реакциях поведает видео ниже:

Имеются два варианта постановки РИФ (реакции Кунса) - прямая и непрямая реакции иммунофлюоресценции.

Прямая РИФ - простая одноэтапная реакция, но так как для ее выполнения требуется наличие большого количества

меченных антимикробных сывороток, то ставится она реже непрямой, постановка которой обеспечивается одной меченной антисывороткой.

Непрямая РИФ - двухэтапная реакция, в которой антиген вначале связывают немеченной видовой сывороткой, а затем образованный иммунный комплекс антиген - антитело обрабатывают меченной ФИТЦ антисывороткой, содержащей антитела против иммуноглобулина этого комплекса. Обычно на I этапе ее постановки в качестве видовой сыворотки используют иммунную кроличью сыворотку, полученную путем иммунизации животных соответствующим микроорганизмом, а на II этапе меченную ФИТЦ антикроличью сыворотку ослов или других животных, иммунизированных гамма-глобулинами кролика (рис. 9).

Постановка прямой РИФ. На обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей - мазки-отпечатки. Препараты высушивают, фиксируют, наносят на них люминесцирующую сыворотку, взятую в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру при температуре 37 °С на 20-30 мин (на 25-40 мин - при комнатной температуре). Затем для удаления избытка флюоресцирующих антител препарат промывают в забуференном изотоническом растворе хлорида натрия в течение 10-15 мин с последующим ополаскиванием в дистиллированной или проточной воде в течение 10 мин. Сушат при комнатной температуре и исследуют под люминесцентным микроскопом с использованием масляной иммерсионной системы.

Для оценки интенсивности специфической флюоресценции бактериальных клеток используется четырехплюсовая шкала: «++++», «+++» - очень яркая и яркая; «++», «+» - выраженная и слабая ободочная зеленая флюоресценция клеток. Обязательными являются три контроля: 1) обработка флюоресцирующими антителами гомологичных бактерий (положительный контроль); 2) гетерологичной культуры (отрицательный контроль); 3) незараженного материала (отрицательный контроль).

Антикомплементарная РИФ. Реакция является модификацией РСК, индикаторной системой в которой служат антикомплементарные антитела, меченные ФИТЦ (рис. 10).

Непрямая антикомплементарная РИФ ставится следующим образом: препарат-антиген готовится на предметном стекле, как для РИФ, но на I этапе обрабатывается не одной иммунной сывороткой, а ее смесью с комплементом морской свинки, а на II этапе - антисывороткой, содержащей меченные ФИТЦ антитела к комплементу. Широкое использование антикомплементарной РИФ ограничено трудностью получения антикомплементарных антител и способа их «метки».